【产品简介】

Zeocin中文名称博来霉素或者腐草霉素D1, 是从轮状链霉菌(Streptomyces verticillus)的一个突变体菌株中分离而来的博来霉素/腐草霉素(bleomycin/phleomycin)的抗生素家族成员。它对细菌、真菌(包括酵母)、植物和哺乳动物细胞均有抑制作用和细胞毒性。

Zeocin 是一种碱性、水溶性的、铜离子螯合的糖肽抗生素。Cu2+螯合的Zeocin溶液呈现蓝色，无活性。当其进入细胞后，Zeocin上的Cu2+被还原为一价铜离子(Cu+), 并被细胞内的巯基化合物(sulfhydryl compound)清除，导致 Zeocin 被活化，能够结合到细胞内 DNA 上并使其断裂，最终导致细胞死亡。

对Zeocin产生抗性的蛋白是来源于印度链球菌(Streptoalloteichus hindustanus)的Shble基因编码一种  14kDa 大小的蛋白，它能够以一定比率结合Zeocin,使其不能结合细胞DNA,抑制其DNA断裂活性，从而使细胞对 Zeocin 产生抗性。因此，Zeocin可用来筛选表达Zeocin抗性基因的多克隆或单克隆细胞，或用于相应的多克隆或单克隆细胞的维持性培养。

Zeocin对于绝大多数好氧细胞均有效，常用于细菌(如大肠杆菌)、真核微生物(如酵母)及动植物细胞的筛选。大肠杆菌筛选推荐浓度为25~50μg/mL(低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L)；酵母筛选推荐浓度为50~300μg/mL(YPD或基本培养基)；哺乳动物细胞筛选推荐浓度为50~1000μg/mL(合适培养基，根据细胞系的类型而不同)。实际应用时，应针对不同的细胞系测试Zeocin的浓度梯度，以确定最佳使用浓度。

【使用方法】

一、细菌的筛选(以大肠杆菌为例)。

1. 使用不含Tn5 转座子元件的宿主细胞如 Top10 、DH5 和 DH10 等进行筛选

2. 需使用低盐LB 培养基以维持Zeocin的活性。

3. Zeocin筛选的推荐浓度为25~50μg/mL。

二、 真菌的筛选(以酵母为例)。

1. 适用于酿酒酵母和毕赤酵母。

2. 培养基的选择：含1M山梨醇的YPD培养基(适用于电穿孔法转染细胞)；YPD或基本培养基(适用于化学法转染细胞)。调整培养基pH至6.5~8.0,并选择使用最低有效浓度的Zeocin进行筛选。

3. 转染方法：需使用电穿孔或锂离子转染法。不要使用酵母原生质球(spheroplasting)进行 Zeocin 抗性的转

染及筛选，因为Zeocin会导致原生质球的完全死亡。

4. Zeocin筛选的推荐浓度为50~300μg/mL。具体浓度与酵母菌株、培养基pH以及离子强度有关。

三、 哺乳动物稳定表达细胞株的筛选。

Zeocin用于哺乳动物细胞筛选常用浓度为50-1000μg/mL (平均常用浓度为250-400μg/mL)。 影响筛选浓度

的主要因素包括离子强度、细胞类型、细胞生长密度以及生长速率。根据细胞类型的不同，需要1-2周可以筛选到 Zeocin 抗性的细胞。在筛选稳定表达细胞株之前，需要先确定能够杀死未转染细胞的 Zeocin 最佳工作浓度。Zeocin 的最佳工作浓度需要通过剂量效应曲线来确定。下表中列出了部分细胞中 Zeocin 的筛选浓度范围以供参考。

四、 细胞对Zeocin敏感性的确定(杀灭曲线的建立)。

1.接种细胞使得细胞密度约为25%,按照8、16或24个细胞培养孔(分别为单个培养孔、复孔和三复孔)准备培养的细胞，培养24h。

2. 去除细胞培养液，换成含不同浓度Zeocin的新鲜筛选培养液(0,50,100,200,400,600,800和1000μg/mL)。

3. 每2-4天更换新鲜的筛选培养液，观察存活细胞的比例，选择在1-2周内杀死所有细胞的最低浓度作为最佳工作浓度。

五 、筛选 Zeocin 抗性的稳定细胞株。

1. 按照20%-30%的细胞密度接种细胞，培养过夜。

2. 转染携带Zeocin抗性基因的质粒或感染携带Zeocin 抗性基因的病毒，同时设置没有转染质粒或感染病毒的细胞作为对照。说明：没有转染质粒或感染病毒的细胞，也需要同样进行转染质粒或感染病毒的相应实验操作。

3. 转染或感染48-72h后，换成含有最佳工作浓度的Zeocin(由步骤四中的杀灭曲线确定)的新鲜培养液，继续培养。如果有必要，可以对细胞进行传代，略稀释后进行筛选培养。

4. 每2-4天更换含有Zeocin的新鲜筛选培养液。

5. 对照组正常细胞100%死亡，Zeocin 抗性组中存活的细胞即为表达Zeocin抗性基因的细胞。然后根据实

验目的进行多克隆或单克隆细胞的筛选。根据细胞种类和转染/筛选效率，单克隆细胞株的形成可能需要一

周或更多的时间。

注意：若待筛选细胞对Zeocin的抗性明显强于大部分细胞，则按照以下方法克服此类耐受性：用含 Zeocin培养液进行细胞接种培养，置于37℃孵育2-3h,使得细胞贴壁。然后将细胞置于4℃,2h。需要使用 HEPES作为培养基的缓冲体系。重新将细胞置于37℃孵育。4℃孵育细胞的目的是短时间内终止细胞分化，使得Zeocin 能发挥作用，杀死细胞。

六、 稳定细胞株的维持培养

可采取如下几种方式之一来维持培养稳定细胞株。

1. 使用含有与上述筛选稳定转染细胞株相同浓度的 Zeocin 筛选培养液来维持培养。

2. 降低 Zeocin 浓度为筛选浓度的一半进行维持培养。

3. 使用刚好能预防敏感细胞生长但不足以致死的Zeocin浓度来维持培养(根据杀灭曲线来判断)。

【注意事项】

1.  Zeocin人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

2.  Zeocin对光敏感，需避光保存于-20℃。含有该抗生素的平板或培养基也需避光保存。

3.  高离子强度、酸或碱性都会抑制Zeocin的活性，该抗生素在过高或过低pH 及弱氧化剂的条件下不稳定，且变性不可逆。在培养细菌时，需适当降低细菌培养基的盐浓度(低盐LB 培养基， NaCl 浓度不能超过5g/L)并调整pH 至7.5,从而使其保持活性。

4.  本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于

普通住宅内。

5.  为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

【保存条件】

-20℃ 避光保存。