普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤---普通PCR

普通PCR

1 概述

聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，缩写：PCR，又称多聚酶链式反应)，是一项利用DNA双链复制的原理，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。透过这项技术，可在短时间内大量扩增目的基因，而不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。

2 PCR原理

PCR技术的基本原理首先基于DNA半保留复制原理，还有碱基互补配对原则，即复制的过程中双链DNA会解链，由双链变成单链，温度一般为95℃；之后温度降下来，引物会结合到DNA单链上，在DNA聚合酶的作用下，把游离的dNTP按照碱基互补配对原则结合到单链上，形成一条由旧链和新链杂合成的新的双链DNA。这个过程可概括为‘变性-退火-延伸’三个基本步骤。

图1  PCR反应简图

一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

变性：利用高温（94℃～98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1～2分钟，接下来机器就控制温度进入循环阶段。

退火（又称复性、降温贴合、缓冷配对、引物黏合）：在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1～2分钟。新技术的融合型核酸聚合酶在此阶段的温度会高于熔点3~5℃，仅需时间5~10秒。

延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000 bp大概需要1分钟、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。有修正功能的则会比较慢。

3 PCR反应体系

表1 标准的PCR反应体系

4 PCR反应特点

4.1特异性强   

PCR反应的特异性决定因素为：

①引物与模板DNA特异正确的结合；

②碱基配对原则；

③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；

④靶基因的特异性与保守性。

4.2 灵敏度高

 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10^-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=10^-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

4.3简便、快速

 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，经过变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

4.4 对标本的纯度要求低

不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

5 PCR 常见问题

5.1假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有：

（1）模板核酸的制备

①模板中含有杂蛋白质；

②模板中含有Taq酶抑制剂；

③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白；

④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；

⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

（2）引物的质量与特异性

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

（3）酶的质量

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

（4）Mg²⁺浓度

Mg²⁺离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

（5）反应体积的改变

通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

（6）物理原因

变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

（7）靶序列变异

如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

5.2 假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

（1）引物设计不合适

选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

（2）靶序列或扩增产物的交叉污染

这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

5.3 出现非特异性扩增带

非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg²⁺离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。对策有：

①必要时重新设计引物；

②减低酶量或调换另一来源的酶；

③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；

④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

5.4出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg²⁺浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。对策为：

①减少酶量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。适当降低Mg²⁺浓度。增加模板量，减少循环次数。