带你走近细胞生物学世界的第一步 ——细胞培养

品科研专栏特约作者：Vicky Hu

细胞培养的概念：

   细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。

细胞培养所需的仪器设备：

细胞培养的过程：

细胞复苏：

将冻存的细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动直到完全融化后放入离心机中，800rpm-1000rpm，5min，然后在超净台中将上清液弃掉，加入1ml预热的培养基，轻轻吹匀后转移到培养瓶中，补足细胞生长所需的培养基，呈“十”混匀后放入含5%CO₂的细胞培养箱中培养。

细胞传代：

待细胞密度达到80%~90%时，弃去原培养基，用5ml PBS清洗3次。加入一定量含0.25% EDTA的胰蛋白酶，放入细胞培养箱中（不同的细胞消化时间不同）。待细胞消化完全后加入胰蛋白酶的3倍体积的含血清培养基进行中和，轻轻吹吸混匀，根据细胞生长特性进行1：2或1：3传代培养。

细胞冻存：

待细胞密度达到80%~90%时，弃去原培养基，用5ml PBS清洗3次。加入一定量含0.25% EDTA的胰蛋白酶，放入细胞培养箱中（不同的细胞消化时间不同）。待细胞消化完全后加入胰蛋白酶的3倍体积的含血清培养基进行中和，轻轻吹吸混匀，转移到离心管中800rpm-1000rpm，5min进行离心，然后在超净台中将上清液弃掉，加入1ml冻存液，放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证梯度降温），立即放入一80℃冰箱内，第二天转入液氮中，可以保存至少两年。

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO。

细胞培养中常见的污染及处理办法：

细菌：在倒置显微镜下呈现细沙状，培养基肉眼可见的变浑浊，对细胞生长有明显的影响。

处理：建议在培养基中添加抗生素，预防用药比污染后用药效果更好。清理掉所有污染的细胞，并重新对细胞培养箱和细胞培养所用的耗材进行高压灭菌。

真菌：一般培养基不会变浑浊，保持清亮，显微镜下可观察到丝状物，有的真菌刚开始会像细胞碎片，慢慢会长出黑色丝状物，对细胞的生长有明显的影响。

处理：一旦有真菌污染，建议丢弃所有被污染的细胞，并重新对细胞培养箱和细胞培养所用的耗材进行高压灭菌。

霉菌：一般培养基仍然清澈但颜色会变黄，显微镜下可观察到丝状物和团块状漂浮物，有明显的菌丝，在细胞培养后期会对细胞生长增殖有影响。

处理：建议扔掉已经污染的细胞，用过氧乙酸擦拭培养箱，紫外线照射细胞间，并在培养基中添加两性霉素，预防再次污染。

原虫：培养基有轻微浑浊，显微镜下可见点状物增多，培养皿底变脏，用高倍镜观察可看到点状物有轻微活动，一般不细胞活力。

处理：可以用缓冲溶液，如PBS多冲洗几次。并注意实验操作环节，更换新的培养基等。

黑胶虫：一般培养基维持清亮状态，低倍可观察到黑色点状，有时候像细胞碎片，高倍镜可观察到黑色点状或杆状物做布朗运动。往往和细胞密度相关，细胞密度高，黑点少，对细胞影响较小。目前关于黑胶虫说法不一，有人认为是不知名的细菌或真菌污染。

处理：可以用缓冲溶液，如PBS多冲洗几次，有一定的缓解作用。建议更换所有的培养基，用质量好的血清，穿戴清洁的白大衣。同时对耗材、细胞培养箱灭菌，对细胞间进行消毒。

支原体：培养基一般无变化，有时在显微镜下也很难观察到具体变化，有时可观察到细胞膜及细胞间隙有很多不动的黑点。对细胞的生长及状态有所影响。

处理：建议对耗材、细胞培养箱灭菌，对细胞间进行消毒。同时在培养基中添加支原体清除剂。

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