【产品组成】

【产品简介】

GUS能催化底物4-MUG产生荧光物质4-MU。4-MU的激发波长为365 nm，发射波长为456 nm。其含量可由荧光分光光度计（或荧光酶标仪）测出。因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量地检测GUS的含量。

荧光分光光度计测定的是相对值，因此用荧光分光光度计测定时必须用标准物4-MU进行校准。

GUS酶活性：每min水解4-MUG成1pmol的4-MU的酶量为一个单位；GUS的表达活性以每mg总蛋白的酶活力表示：4-MU pmol/ min /mg

【保存】

-20℃保存，保质期18个月。

【使用方法】

1、总蛋白的提取及浓度测定

（1）取新鲜的植物组织100 mg左右，用液氮将材料急速冷冻，然后采用液氮研磨的方式在研钵里磨碎组织。如果无法立即研磨，可以先将液氮冷冻处理的植物组织储存于-80℃冰箱。

注：为了能够提取有效成分并确保样品中的蛋白质不会被降解，从而保证后续分析的准确性和可靠性，可以加入1%蛋白抑制剂和1% PMSF（苯甲基磺酰氟）。

（2）将研磨破碎的组织转到EP管里，并立即加入1 mL的GUS提取液，充分混匀。

（3）12, 000 rpm，4℃离心10 min。

（4）将上清转至另一洁净的EP管，12, 000 rpm，4℃离心10 min。

（5）所得上清即为蛋白提取物，可以置于冰上待用，或者-80℃保存。

（6）取195μl的考马斯亮蓝溶液(4:1稀释)，取蛋白上清5μL，用枪头搅匀，避免气泡产生。室温放置10 min，测定595 nm光吸收值，根据蛋白标准曲线计算样品总蛋白浓度。

2、所用的标准曲线的制定

2.1 蛋白标准曲线的制定（每次测GUS蛋白活性时，蛋白标准曲线都要当日重新制定。）

称取10mg的BSA粉末，用10ml GUS提取液溶解，配成10mg/ml的BSA溶液。然后梯度稀释至0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg/ml的溶液。考马斯亮蓝溶液按1：4的比例稀释。在96孔板中分别加入195μL的考马斯亮蓝溶液，再加入5ul的BSA溶液，搅拌至溶液颜色呈蓝色，静止10 min。每个浓度重复三次。用酶标仪测出各个孔的OD595值，去掉空白，制成类似图1的标准曲线，其中，OD595值为纵坐标，BSA溶液浓度为横坐标。

图1  GUS蛋白标准曲线

2.2 4-MU标准曲线的制定（一次即可，换算时只用到下面的线性方程）

工作液：采用依次倍比稀释--将4mM的4-MU用反应终止液（0.2M的Na2CO3）稀释成下表中的浓度。测定各个浓度的荧光强度值（RFU），制成标准曲线（类似图2）。

图2 4-MU标准曲线

线性方程为Y=6.30355+0.21794＊X  R2=0.99972

3.GUS荧光检测

（1）取一只（7.2mg） MUG粉末，溶于10ml GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。注：本品每次现配最佳，剩余溶液避光4℃保存，如无需配制10ml，可按比例减少配制量。

（2）在111.2 μLGUS提取缓冲液（无蛋白抑制剂）中加入125μL  4-MUG溶液，37℃预热。

（3）上述液体中加入12.5μL蛋白上清，立即取30μL加入到270μL Na2CO3反应终止液中(0时的空白对照)，37℃温浴，严格定时，5min，15min，30min，45min和60min各取30ul，加入270μL反应终止液，同时制备空白对照（GUS提取缓冲液与4-MUG溶液的混合液）。每个样品重复三次。

（4）用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，狭缝10nm时测定不同时间点的荧光强度值（RFU）。去除空白值，根据标准曲线，换算成4-MU的浓度。

4.GUS酶活性的计算

（1）根据蛋白标准曲线，595nm下的OD值，计算出总蛋白的浓度(mg/ml)。

（2）根据4-MU的标准曲线，得出由样品蛋白反应得到的4-MU的浓度(nmol/L)=(RFU-6.30355)/0.21794

（3）求出4-MU浓度与时间的比值Kt。（即4-MU浓度为纵坐标，时间为横坐标，求出斜率Kt）

（4）求出GUS酶活=4-MU量与时间的比值Kt/样品蛋白的量*稀释倍数。

注：

①测烟草样品或GUS活性不强的水稻组织样品时，上述所加液体的量无需变化，稀释倍数为200倍，GUS酶活为200~30000 pmol 4-MU/ min/ mg protein。

②若为强启动子的水稻组织样品，如actin、Ubi等，在GUS荧光测定时，加入的蛋白量要减少，蛋白与4-MUG的混合液要减少，Na2CO3终止液要增加，以保持300μL的总体积。算出稀释倍数，GUS酶活约为50~1000 nmol 4-MU/ min/ mg protein。